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冷冻胚胎生产技术

浏览次数:正在读取 / 编辑:admin / 更新时间:2011-08-30
胚胎移植是将一头良种母牛配种后的早期胚胎取出,移植到另一头母牛体内,使之继续发育成为新的个体。 所以,也有人通俗地称之 "借腹怀胎"。 肉牛的品质不仅决定于其父方,也决定于其母方。胚胎移植正是根据这一点,充分利用优质母牛资源,将其与优质公牛配种,从而产生最优秀的后代。 购买冷冻精液后,与当地母牛配种,产生的是杂种牛;购买冷冻胚胎后,移植到当地母牛体内,产生的是进口优质肉牛;其品质和价值都远远高于杂种牛。 而且用于配种的母牛、公牛均经过严格、科学的挑选,其胚胎的品质自然出众。 此外,引进的胚胎由于在当地出生、生长,容易适应本地环境条件,可以从养母处得到一定的免疫能力,而引进的活牛不具备这些优点。 从经济方面考虑,购买冷冻胚胎可以大大降低购买费用、运输费用。无须饲养种公牛种母牛,节约了饲养费、管理费,而且没有牛只发生意外的风险   胚胎生物工程是胚胎移植技术的延伸,包括胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎融合、核移植、胚胎性别鉴定、卵母细胞的体外培养与体外受精及基因导人等。这些技术的出现不仅大大扩展了胚胎移植的研究与应用领域,而且展现出促进畜牧业发展的广阔前景,具有重大的理论意义和经济效益。
  (一)胚胎冷冻保存 要建立胚胎库和长途运送胚胎,就需要解决胚胎冷冻保存问题。冷冻保存的方法大体可分为缓慢冷冻、快速冷冻、玻璃化冷冻三类。快速冷冻的主要操作过程如下:
  1.冷冻液 一般用加有10%~20%的胎犊血清(FCS)的杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)来配制,防冻剂可采用甘油或二甲亚枫(DMSO)等。也可用1摩尔浓度的甘油作为冷冻液。
  2.冷冻 将胚胎洗净后置于1摩尔浓度的甘油溶液中,在室温下平衡10分钟,用O.25毫升细管包装胚胎,用聚乙醇粉末封口。细管放人0℃冷冻仪,以1℃/分钟速度降温,-7℃诱发结晶(用在液氮中冷却的镊子夹细管含胚段上端1/3处)。随后将冷冻仪以0.5℃/分钟(O.3~O.8℃分钟)降至—30℃,投入液氮。
  3.解冻 于35℃水浴中解冻后,剪断封口,将胚胎回收于干燥洁净表面皿内;分别间隔5分钟,依次通过1摩、O.75摩、0.5摩、O.25摩的甘油磷酸盐缓冲液,最后通过10%胎犊血清——磷酸盐缓冲液洗2—3次,然后进行移植或体外培
养。
  (二)胚胎分割 胚胎分割就是用显微外科方法将胚胎分为两个或多个,目前已被用于增加农畜的胚胎来源,并且可以产生许多同卵双生后代。分割后的两枚半胚,即使性别不明,也可移植给同一头受体牛,而不必担心造成异性孪生母犊不育。
  胚胎分割前,一般均需先准备好空透明带,然后将分割后的胚细胞团移人空透明带内。
牛分割后的两枚半胚,还可以移植一枚,冷冻储存一枚。如果所移植的半胚获得一头公牛,家畜改良站即可进行半胚公牛的遗传性能测定。如果证明是优秀个体,数年后将另一半胚胎解冻,移植成功,可得到遗传性能完全相同的孪生公牛。
  胚胎分割的操作一般在显微镜下进行。Leitz显微操作仪是进行胚胎分割的最佳设备。这种操作仪实际上就是在显微镜上装上机械手,胚胎的固定及分割都是通过操纵机械手实现的。
  (三)胚胎融合  胚胎融合又称嵌合体制作,就是将两个不同品种或不同种除去透明带胚(裸胚)粘合在一起,或者各自一分为二,然后各取一半,融合成新的胚胎,移植给受体,产生具有杂交优势的新后代——嵌合体。
  胚胎融合技术不仅为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段,而且业已证实,嵌合体后代可集不同品种或不同种动物的不同基因于一体,完全有可能把母代动物的优良遗传性能集中表现出来,从而形成具有高度杂种优势的杂合体。另外,嵌合体母畜与公畜交配后,能产生具有正常繁殖力的后代。所以胚胎融合不仅可成倍缩短家畜改良时间,而且也为创造新型的家畜品种提供新的技术手段。
  胚胎融合的主要方法有以下两种:
  1.石蜡油挤压法 在塑料培养皿上做好20—30微升的联结用培养液小滴,上盖石蜡油。培养液滴中放人要联结的两个品系的裸胚(通常各一个),在显微镜下用细玻璃棒轻轻拔在一起使之联结。联结用的培养液中一般要加联结剂——植物血凝素。没有联结剂,联结也能进行。室温下放置15分钟,使联结完成后,要用培养液洗两次,再继续培养或作移植。
  2.内细胞团囊胚注入法 即将一个品系的单个卵裂球注入另一品系胚胎的囊胚腔中。
  (四)卵核移植  就是将优良母畜胚胎的卵裂球分离开来,获得几十个具有优良遗传基因的供体核,然后将这些供体核分别注入一般母畜的去核卵子中,产出遗传素质相同的后代。其目的是由一个优良胚胎(同卵)生出更多的优良后代,进一步提高优良母畜的繁殖潜力。
  (五)胚胎性别鉴定 胚胎性别鉴定就是在胚胎移植之前对胚胎进行性别鉴定,来控制下一代的性别,使之达到理想的性别比例,或者让母牛只怀同性双胎,避免产生异性孪生母犊。
  性别鉴定的方法主要有两种:
  1.组织学方法 其生理基础是雄性家畜性染色体组合为XY,雌性家畜性染色体组合为XX。采取一部分胚胎组织,立即固定有丝分裂细胞,并对胞核进行染色,制成染色体标本,根据检出的XX、XY染色体来进行性别鉴定,再把剩余的胚胎组织移植到子宫内,使之继续发育。
  2.免疫学方法 H--Y抗原为雄性哺乳动物细胞膜所特有,而雌性动物细胞膜则无此抗原,通过检测胚胎细胞膜上是否存在H--Y抗原即可鉴别其性别。免疫学鉴定法的操作技术有以下两种:
  (1)细胞毒性试验 是将胚胎孵育于加有补体(多用豚鼠血清)和H--Y抗血清的培养液中,观察孵育的结果。如果胚胎含H--Y抗原,发育就会受阻或发生变性溶解现象;如不含H--Y抗原,胚胎可继续发育。本法虽具较高的准确性,但能使雄性胚胎受到破坏。
  (2)间接免疫荧光法 本法需要用绿色荧光染料异硫氰酸荧光素标记的抗体。首先除去胚胎透明带,将其与第一抗体(H--Y抗体)一起孵育,继之与标记的第二抗体(抗H--YR抗体的抗体)孵育,然后用荧光显微镜检查,就会发现有的胚胎带荧光(多为雄性),有的胚胎不带荧光(多为雌性)。本法的优点在于不破坏雄性胚胎,也不影响胚胎活力。
  (六)体外受精 体外受精就是采取雌性动物的卵子和雄性动物的精于,使其在试管中受精。据报道,商品犊牛在屠宰前用激素处理,一次可有20~50个卵泡发育,可获得20~50个卵母细胞,因而体外受精技术可充分挖掘优良母牛的生育潜力。
  第一头体外受精犊牛1981年在美国宾西法尼亚州诞生。
  (七)基因导入  基因导入就是给胚胎注入外源基因,增加新的遗传物质,并使之在后代中能稳定表达出来。这种技术可达到两个目的,一是加快动物生产性能的改良速度;二是实现常规选择和杂交不能实现的目标。但是,只有在有用的或符合需要的性状如多胎性、生长快、抗病性的基因可以分离出来,并在动物体内的表达可以控制时,才能应用这种技术。

 
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